10月27日,中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院于濤課題組的最新研究成果以“Metabolic reconfiguration enable synthetic reductive metabolism in yeast”為題發(fā)表于Nature Metabolism。研究團(tuán)隊(duì)通過理性設(shè)計(jì),組合磷酸戊糖循環(huán)、轉(zhuǎn)氫循環(huán)和外部呼吸鏈三個(gè)模塊,在酵母細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建了一個(gè)合成能量系統(tǒng),其可以支持細(xì)胞生長和高還原性化合物的生產(chǎn),并實(shí)現(xiàn)40%的自由脂肪酸產(chǎn)率,為目前釀酒酵母研究的最高水平。
該成果由中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院于濤實(shí)驗(yàn)室與查爾姆斯理工大學(xué)Jens Nielsen實(shí)驗(yàn)室合作共同完成,于濤研究員為第一作者兼共同通訊作者,深圳先進(jìn)技術(shù)研究院博士生王湘,研究助理劉香健也為研究作出重要貢獻(xiàn)。
文章上線截圖
(資料圖片僅供參考)
于濤團(tuán)隊(duì)致力于利用合成生物學(xué)方法,解決可持續(xù)制造、綠色能源的生物存儲(chǔ)與糧食安全等重大問題。前期工作中,團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了空氣中CO2到葡萄糖與脂肪酸的制備(Nature Catalysis,2022),本工作開發(fā)的合成的能量系統(tǒng)(細(xì)胞雙引擎),進(jìn)一步提高了脂肪酸的轉(zhuǎn)化率,并為下一步開發(fā)可再生能源的生物儲(chǔ)能技術(shù)打下了基礎(chǔ)。
細(xì)胞在生長過程中合成大分子、構(gòu)建碳骨架,這些過程消耗能量,且需要克服底物和生物量之間的還原度差異。對于脂質(zhì)等高價(jià)值的儲(chǔ)能化合物,其還原度遠(yuǎn)高于葡萄糖等底物,細(xì)胞往往需要額外的還原力和能量來合成這些化合物。而這無疑需要對細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重構(gòu),因?yàn)榧?xì)胞獲取能量和還原力、合成大分子和構(gòu)建碳骨架的目的是為自身生長,而不是產(chǎn)品合成。因此,研究者們構(gòu)想,是否有可能從頭構(gòu)建一個(gè)合成的能量系統(tǒng),其是否可以取代內(nèi)源的能量系統(tǒng)為細(xì)胞供應(yīng)能量支撐生長?其是否能為化學(xué)品合成提供額外的能量和還原力?細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)高度協(xié)作,胞內(nèi)的能量和物質(zhì)組成維持在一定的比例,細(xì)胞是否能接受過量的NADPH和NADH?
研究團(tuán)隊(duì)通過理性重排還原代謝,在酵母細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建了一個(gè)新型合成能量系統(tǒng),利用重復(fù)的單脫羧反應(yīng)和轉(zhuǎn)氫循環(huán)實(shí)現(xiàn)NADPH和NADH的合成,并進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰窟M(jìn)行釋放。該系統(tǒng)由三個(gè)模塊組成:磷酸戊糖(Pentose Phosphate,PP)循環(huán)、轉(zhuǎn)氫循環(huán)和外部呼吸鏈(圖1)。
圖1:合成能量系統(tǒng)示意圖
PP循環(huán)與轉(zhuǎn)氫循環(huán)的構(gòu)建
重復(fù)脫羧是細(xì)胞還原代謝的基礎(chǔ),因此要構(gòu)建一個(gè)新的能量系統(tǒng)首先就是要構(gòu)建一個(gè)重復(fù)脫羧循環(huán)。磷酸戊糖途徑中,6-磷酸葡萄糖(G6P)被催化為5-磷酸核糖(R5P)時(shí)失去一分子CO2,生成2分子NADPH,此為氧化階段;之后C5分子經(jīng)可逆重排,最終重構(gòu)為6-磷酸果糖(F6P)和3-磷酸甘油醛(G3P),此為非氧化階段;G3P經(jīng)部分糖異生途徑可以回到G6P,再一次進(jìn)入氧化階段,這樣就構(gòu)成了PP 循環(huán)。在這個(gè)循環(huán)中,1分子葡萄糖徹底氧化可以生成12分子NADPH。NADPH是細(xì)胞內(nèi)的還原力通量,而NADH經(jīng)過氧化呼吸鏈可以生成ATP。研究者過表達(dá)酵母內(nèi)源谷氨酸鹽轉(zhuǎn)氫酶GDH1和GDH2,在胞質(zhì)內(nèi)實(shí)現(xiàn)1分子NADPH不可逆轉(zhuǎn)變?yōu)?分子NADH的轉(zhuǎn)氫循環(huán)(圖2a)。
研究者選擇了一株消除葡萄糖效應(yīng)的丙酮酸脫羧酶缺陷菌株E1B[1](重命名為SynENG001)來測試PP循環(huán)和轉(zhuǎn)氫循環(huán)的碳通量。該菌株以氧化磷酸化為主要供能過程,可以在單一葡萄糖碳源上生長,且具有較好的胞質(zhì)NADH平衡能力。研究者敲除了磷酸果糖異構(gòu)酶基因pgi1,打斷了糖酵解途徑,提高了PP循環(huán)碳通量,得到的菌株SynENG064不能以糖為單一碳源生長;而在添加轉(zhuǎn)氫循環(huán)后,得到的菌株SynENG065在5天內(nèi)可以生長到OD600 nm=10(圖2b)。由此可推測敲除pgi后胞內(nèi)的NADPH過量,對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制。在野生型酵母內(nèi)敲除pgi并過表達(dá)GDH2僅能部分恢復(fù)細(xì)胞生長,研究者推測這是由于轉(zhuǎn)氫循環(huán)產(chǎn)生的過量NADH抑制細(xì)胞生長,因此細(xì)胞需要一個(gè)有效的呼吸鏈來解除胞質(zhì)內(nèi)多余的NADH。以上結(jié)果證實(shí)PP循環(huán)和轉(zhuǎn)氫循環(huán)運(yùn)行良好,且兩個(gè)模塊有較高的碳通量。
圖2:通過轉(zhuǎn)氫循環(huán)解除NADPH過量產(chǎn)生的毒性。a. PP循環(huán)和不可逆的轉(zhuǎn)氫循環(huán)。b. 轉(zhuǎn)氫循環(huán)恢復(fù)了pgi1缺失導(dǎo)致的生長缺陷。SynENG064菌株敲除了pgi1,SynENG065菌株敲除pgi1同時(shí)過表達(dá)了GDH1和GDH2(轉(zhuǎn)氫循環(huán))
琥珀酸是一種四碳二羧酸,從丙酮酸合成琥珀酸需要細(xì)胞提供額外的還原力NADH。研究者在SynENG001菌株中過表達(dá)了琥珀酸合成所需要的各基因,并下調(diào)了磷酸果糖激酶(PFK)的表達(dá)水平推動(dòng)碳流更多流向PP循環(huán),使琥珀酸的產(chǎn)量升至約3.3 g/L(圖3)。在此過程中研究者還發(fā)現(xiàn)了甘油的積累,這些都說明PP循環(huán)和轉(zhuǎn)氫循環(huán)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的NADH過剩。
圖3.合成能量系統(tǒng)產(chǎn)生過量NADH供給高還原度化學(xué)品合成。a. 磷酸果糖激酶下調(diào)的PP循環(huán)示意圖。b. PP循環(huán)結(jié)合轉(zhuǎn)氫循環(huán)提高了琥珀酸的生產(chǎn)。c. PP循環(huán)結(jié)合轉(zhuǎn)氫循環(huán)提高了甘油的生產(chǎn)
研究者模擬線粒體內(nèi)的氧化呼吸鏈,表達(dá)了兩種外部NADH脫氫酶NDE1和NDE2,將胞質(zhì)NADH與線粒體電子傳遞鏈聯(lián)系起來,得到菌株SynENG012(圖4a-b)。在下調(diào)TCA循環(huán)關(guān)鍵基因異檸檬酸脫氫酶IDH2的表達(dá)水平時(shí),細(xì)胞生長逐漸受損乃至致死;放入合成能量系統(tǒng)(轉(zhuǎn)氫循環(huán)和外部呼吸鏈)后,細(xì)胞生長不受影響(圖4c-d)。這些說明合成能量系統(tǒng)可以替代胞內(nèi)原有能量系統(tǒng)發(fā)揮作用,支持細(xì)胞生長。
圖4.合成能量系統(tǒng)支持細(xì)胞生長。a. 雙能量引擎設(shè)計(jì)示意圖。b. 雙能量系統(tǒng)的過度脫羧導(dǎo)致細(xì)胞生長受損。c. 無合成能量系統(tǒng)時(shí),TCA循環(huán)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞生長受損。d. 合成能量系統(tǒng)可替代TCA循環(huán)支持細(xì)胞生長
利用合成能量系統(tǒng)促進(jìn)脂質(zhì)生產(chǎn)
自然界的產(chǎn)油真菌中線粒體內(nèi)的異檸檬酸脫氫酶受損會(huì)導(dǎo)致油脂的過度生產(chǎn),因此先前的研究中,研究者在已優(yōu)化的產(chǎn)自由脂肪酸(Free Fatty Acids,F(xiàn)FAs)菌株動(dòng)態(tài)調(diào)控IDH2的表達(dá),得到菌株Y&Z032[2]。但是搖瓶發(fā)酵后細(xì)胞生長和FFAs產(chǎn)量都下降了。研究者推測這是由于胞內(nèi)能量供應(yīng)不足,因此放入了轉(zhuǎn)氫循環(huán)和外部呼吸鏈,得到的菌株SynENG024生物量相對提高100%,F(xiàn)FA產(chǎn)量提高200%(圖5a-c)。這也進(jìn)一步印證了合成能量系統(tǒng)可以支持細(xì)胞生長和高還原性化合物的生產(chǎn)。
此外,研究者還過表達(dá)不同來源的果糖-1,6-二磷酸酶FBP1來提高NADPH供應(yīng)(圖5d);使用不同的啟動(dòng)子微調(diào)NADPH和ATP的比例,但并未觀察到FFAs產(chǎn)量的明顯提高。因此在胞內(nèi)表達(dá)了非氧化糖酵解(Non-oxidative glycolysis,NOG)途徑,將PP途徑部分分流到乙酰輔酶A的合成。如預(yù)期所料,F(xiàn)FAs產(chǎn)量提高了30%(圖5e)。這說明最優(yōu)生產(chǎn)需要結(jié)合多策略實(shí)現(xiàn)。
分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,研究者在FFAs生產(chǎn)的最佳菌株SynENG050中恢復(fù)了完整功能的TCA循環(huán)來避免高濃度乙醇的積累,又過表達(dá)一份FFAs合成途徑來競爭碳源和消耗過多的NADH,得到菌株SynENG058,發(fā)酵后使用Dodecane進(jìn)行提取,得到20 g/L的FFAs,產(chǎn)率達(dá)到0.134 g FFAs/g葡萄糖,為最高理論得率的40%(圖5f)。
圖5.合成能量系統(tǒng)提高FFAs生產(chǎn)。a. 雙能量引擎供給FFAs生產(chǎn)示意圖。b. 合成能量系統(tǒng)可替代TCA循環(huán)支持細(xì)胞生長。c. 合成能量系統(tǒng)可替代TCA循環(huán)支持FFAs生產(chǎn)。d. 果糖-1,6-二磷酸酶過表達(dá)提高了FFAs的生產(chǎn)。e. NOG途徑與合成能量系統(tǒng)協(xié)作提高了FFAs的生產(chǎn)。f. 限糖限氮條件下SynENG058菌株的補(bǔ)料分批發(fā)酵。
生物技術(shù)的挑戰(zhàn)之一是如何在剛性代謝網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上改變胞內(nèi)能量(ATP)和還原力(NADH/NADPH)的相對化學(xué)計(jì)量比,來積累過量能量/還原力進(jìn)行產(chǎn)品合成。本文構(gòu)建了一個(gè)合成能量系統(tǒng)為細(xì)胞供給額外的能量和還原力,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,該系統(tǒng)可替代原有的TCA循環(huán),可支持高還原度化學(xué)品的生產(chǎn),也可與其他途徑合作高效生產(chǎn)以乙酰輔酶A為前體的化學(xué)品。這是第一個(gè)通過理性設(shè)計(jì)構(gòu)建的合成能量系統(tǒng),這項(xiàng)研究揭示了細(xì)胞能量代謝網(wǎng)絡(luò)的可塑性:盡管經(jīng)過了幾百萬年的進(jìn)化,細(xì)胞的能量代謝網(wǎng)絡(luò)依然可以重構(gòu)。
該研究工作獲得國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2020YFA0907800,2021YFA0911000)、國自然面上基金(NSFC 32071416)、深圳合成院交叉項(xiàng)目(JCHZ20200003)、深圳市微生物藥物智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及深圳市合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。
參考文獻(xiàn):
[1] Zhang, Y. et al. Adaptive mutations in sugar metabolism restore growth on glucose in a pyruvate decarboxylase negative yeast strain. Microb Cell Fact 14, 116, doi:10.1186/s12934-015-0305-6 (2015).
[2] Yu, T. et al. Reprogramming Yeast Metabolism from Alcoholic Fermentation to Lipogenesis. Cell 174, 1549-1558 e1514, doi:10.1016/j.cell.2018.07.013 (2018).
標(biāo)簽: 合成能量系統(tǒng)